Efeitos da obesidade induzida por dieta hipercalórica e de seu tratamento com exenatida sobre a neurotransmissão colinérgica muscarínica em hipocampo de ratos / Effects of obesity induced by hypercaloric diet and its treatment with exenatide on the muscarinic cholinergic neurotransmitter in rat hippocampus

Introduction: Molecular cloning studies have revealed the existence of five distinct muscarinic acethylcholine receptor (mAChRs) subtypes (M1 to M5), which interact, via a G protein-regulated process, with multiple effector systems. The M1, M3 and M5 subtypes couple primarily to PLC-mediated phosphoinositide hydrolysis, while the M2 and M4 subtypes couple primarily to adenylyl cyclase inhibition. In the Hippocampus, the modulation of excitatory transmission by mAChRs seems particularly relevant to learning and memory processing in the hippocampal formation, where the diversity and differential localization of the receptors are likely to account for the complex cholinergic modulation in this structure. Experimental studies has been shown that obesity-associated with hypercaloric diet impair learning and memory in rodents, suggesting a strong association between obesity and cognitive dysfunction. However, the mechanisms of how the obesity induced by hypercaloric diet affect memory are not understood fully. Objective: The aim of this study was to investigate the possible effects of obesity induced by hypercaloric diet and its treatment with exenatide, an antidiabetogenic and potential antiobesogenic drug derived from the venom of the Gila monster Heloderma suspectum, on the affinity, density, subtypes and intracellular signaling pathways linked to activation of mAChRs in rat hippocampus. Methodology: Male Wistar rats were divided into three groups: control (CT), obese induced by hypercaloric diet (DIO) and DIO treated with exenatide (DIO+E). The experimental procedures were approved by the Research Ethics Committee of the Butantan Institute (# 22381003/17). In the hippocampus obtained from CT, DIO and DIO+E were performed: I- [ 3H]QNB binding to determine the affinity (KD) and density (Bmax) of mAChRs; II- Expression of each mAChR subtype (M1 to M5) by immunoprecipitation assays and III- Determination of [3H]inositol phosphates accumulation. Results: Specific binding analysis showed that the affinity did not differ among CT, DIO and DIO+E. In contrast, the density of mAChRs obtained in DIO animals was lower than that obtained from CT rats. Moreover, the density of mAChRs from DIO+E was similar when compared with CT rats. Immunoprecipitation assays induced a decrease in the expression of M1 and M3 subtypes of DIO animals when compared with CT. Treatment with exenatide (DIO+E) recovered the expression of the two subtypes similar to CT. On the other hand, the M2, M4 and M5 subtypes did not differ among CT, DIO and DIO+E. Carbacol caused a concentration-dependent increase in the accumulation of [3 H]inositol phosphates in the 3 experimental groups. However, the magnitude of the maximal response to carbachol was lower in the DIO group compared to CT and DIO+E animals, which did not differ from each other. Conclusion: Our results indicate that obesity induced by hypercaloric diet strongly influences the expression and intracellular signaling coupled to M1-M3 subtypes. The exenatide reversed these effects, suggesting an important role on hippocampal muscarinic cholinergic system. This action of obesity might be a key step mediating cellular events important for learning and memory.

Introdução: Estudos de clonagem molecular revelaram a existência de cinco diferentes subtipos de receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) (M1-M5) que interagem com múltiplos sistemas efetores através de um processo regulado pela proteína G. Os subtipos M1, M3 e M5 acoplam-se principalmente à hidrólise do fosfoinositídeos mediada pela fosfolipase C. Por outro lado, os subtipos M2 e M4 acoplam-se principalmente à inibição da adenililciclase. No hipocampo, a modulação da transmissão excitatória pelos mAChRs é relevante para o aprendizado e o processamento da memória aonde a diversidade e a localização diferencial dos mAChRs são responsáveis pela complexa modulação colinérgica nessa estrutura. Estudos experimentais demonstraram que a obesidade induzida por dieta hipercalórica prejudica o aprendizado e a memória em roedores, sugerindo uma associação entre obesidade e disfunção cognitiva. No entanto, os mecanismos pelos quais a obesidade afeta os processos cognitivos não são totalmente compreendidos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis efeitos da obesidade induzida por dieta hipercalórica e seu tratamento com exenatida, uma droga anti- diabetogênica e anti-obesogênica, derivada do veneno do Monstro-de-Gila (Heloderma suspectum), sobre a afinidade, densidade, subtipos e sinalização intracelular acoplada à ativação de mAChRs no hipocampo de ratos. Metodologia: Ratos machos Wistar foram divididos em três grupos: controle (CT), obeso induzido por dieta hipercalórica (DIO) e DIO tratado com exenatida (DIO+E). Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Butantan (no 22381003/17). No hipocampo obtido de animais CT, DIO e DIO+E foram realizados: I- Ensaios de saturação da ligação do [3H]QNB para determinar os parâmetros farmacológicos KD (afinidade) e Bmax (densidade); II- A expressão de cada subtipo de receptor muscarínico (M1 a M5) por ensaios de imunoprecipitação com anticorpo que reconhece cada um dos subtipos de mAChRs e III- Determinação do conteúdo intracelular de [3H]fosfatos de inositol. Resultados: A análise da ligação específica mostrou que a afinidade não diferiu entre os grupos CT, DIO e DIO-E. Contrariamente, a densidade de mAChRs obtida nos animais DIO foi menor que a observada em ratos CT. A densidade dos animais DIO+E foi similar ao CT. Animais DIO induziram uma diminuição na expressão dos subtipos M1 e M3 quando comparada com o CT. O tratamento com exenatida (DIO+E) recuperou a expressão dos dois subtipos similar ao CT. Por outro lado, os subtipos M2, M4 e M5 não diferiram entre os grupos CT, DIO e DIO+E. O carbacol causou um aumento, dependente da concentração, sobre o acumulo de [3H]fosfatos de inositol nos 3 grupos experimentais. Entretanto, a magnitude da resposta máxima ao carbacol foi menor no grupo DIO comparativamente aos animais CT e DIO+E que não diferiram entre si. Conclusão: Nossos resultados indicam que a obesidade induzida por dieta hipercalórica, influência de maneira contundente, por meio da diminuição da expressão e sinalização intracelular acoplada aos subtipos M1 e M3. A exenatida reverteu esses efeitos, sugerindo ter um papel importante na neurotransmissão colinérgica muscarínica hipocampal. O presente estudo é também o primeiro passo para outras abordagens como a avaliação da importância funcional dessa modulação sobre os mAChRs no hipocampo.

Protección miocárdica por estimulación vagal en la lesión por isquemia y reperfusión en ratones

Introducción: Previamente se demostraron beneficios de la estimulación vagal (EV) prolongada en el infarto de miocardio. No obstante, se desconocen los efectos y los mecanismos de protección cuando se aplica en forma selectiva y brevemente antes de la isquemia o al inicio de la reperfusión. Objetivo: Estudiar si la EV en la reperfusión reduce el tamaño del infarto de manera similar a la EV preisquémica y si en ambas la protección está mediada por receptores muscarínicos o nicotínicos. Material y métodos: En ratones FVB se realizó una isquemia miocárdica regional de 30 minutos y 2 horas de reperfusión sin EV (I/R), con EV preisquémica por 10 minutos (EVp), con EV preisquémica y bloqueo muscarínico con atropina y con EV preisquémica y bloqueo nicotínico a-7 con metilicaconitina. También se estudiaron los efectos de la EV al inicio de la reperfusión (EVr), con atropina y con metilicaconitina. Se cateterizó el ventrículo izquierdo para medir la función ventricular. Se midió el área de riesgo con azul de Evans y el área de infarto con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio. Resultados: La EVr redujo el tamaño del infarto de forma similar a la EVp, aunque los mecanismos de protección fueron diferentes. La EVp protegió a través de la activación colinérgica de los receptores muscarínicos. La EVr, en cambio, protegió por una vía colinérgica nicotínica a-7. Conclusión: El presente estudio demuestra por primera vez en un modelo de isquemia y reperfusión miocárdica en ratones que una EV breve de 10 minutos es capaz de reducir de manera similar el tamaño del infarto, tanto cuando se aplica previo a la isquemia como en el inicio de la reperfusión, mimetizando de esta manera al precondicionamiento y al poscondicionamiento isquémicos, respectivamente.

Atropine is more efficient than ZM241385 to reduce a drastic level of fade caused by cisatracurium at 50 Hz / Atropina é mais eficiente que ZM241385 para reduzir o intenso nível de fadiga causada por cisatracurium a 50 Hz

The effects of atropine (non selective muscarinic antagonist) and ZM241385 (A2A receptors antagonist) in the cisatracurium-induced drastic (100%) level of fade at 50 Hz (10 s) (100% Fade) were compared in the phrenic nerve-diaphragm muscle preparations of rats indirectly stimulated at a physiological tetanic frequency (50 Hz). The lowest dose and the instant cisatracurium caused 100% Fade were investigated. Cisatracurium induced 100% Fade 15 min after being administered. Atropine reduced the cisatracurium-induced 100% Fade, but the administration of ZM241385 separately, or combined with atropine, did not cause any effect in the cisatracurium-induced 100% Fade. Data indicate that the simultaneous blockage of M1 and M2 muscarinic receptors on motor nerve terminal by atropine is more efficient than the blockage of presynaptic A2A receptors for a safer recovery of patients from neuromuscular blockade caused by cisatracurium.

Os efeitos de atropina e ZM241385 (antagonistas de receptores A2A) no drástico (100%) nível de fadiga (100% Fadiga) produzido pelo cisatracúrio a 50 Hz (10 s) foram comparativamente investigados em preparações nervo frênico músculo diafragma isolado de ratos indiretamente estimuladas com a frequência fisiológica tetanizante de 50 Hz. A menor dose e o instante no qual cisatracúrio causou 100% Fadiga foram pesquisados. O cisatracúrio induziu 100% Fadiga 15 min depois de ser administrado. A atropina reduziu a fadiga de 100% causada pelo cisatracúrio, mas ZM241385, ou a administração combinada de atropina com ZM241385, não causou qualquer efeito na 100% Fadiga produzida pelo cisatracúrio. Os dados indicam que o bloqueio simultâneo dos receptores muscarínicos M1 e M2 no terminal nervoso motor pela atropina é mais eficiente do que o bloqueio dos receptores pré-sinápticos A2A no auxilio da recuperação mais segura do bloqueio da transmissão neuromuscular causada por cisatracúrio.

Functional and biochemical characteristics of urinary bladder muscarinic receptors in long-term alloxan diabetic rats / Características funcionais e bioquímicas dos receptores muscarínicos da bexiga de ratos com diabetes crônico induzido por aloxana

Objective To re-examine the function of the urinary bladder in vivoas well as to determine the functional and biochemical characteristics of bladder muscarinic receptors in long-term alloxan-induced diabetes rats.Methods Two-month-old male Wistar rats were injected with alloxan and the animals showing blood glucose levels >300mg/dL together with age-paired untreated animals were kept for 11 months. Body weight, bladder weight, blood glucose, and urinary volume over a period of 24 hours were determined in both groups of animals. A voiding cystometry in conscious control and diabetic rats was performed to determine maximal micturition pressure, micturition contraction interval and duration as well as voided and post-voiding residual volume. In addition, concentration-response curves for bethanechol in isolated bladder strips, as well as [3H]-N methyl-scopolamine binding site characteristics in bladder homogenates were determined.Results Mean bladder weight was 162.5±21.2mg versus 290±37.9mg in control and treated animals, respectively (p<0.05). Micturition contraction amplitude (34.6±4.7mmHg versus 49.6±2.5mmHg), duration (14.5±1.7 seconds versus 23.33±4.6 seconds) and interval (87.5±17.02 seconds versus 281.11±20.24 seconds) were significantly greater in alloxan diabetic rats. Voided urine volume per micturition contraction was also significantly higher in diabetic animals. However the post-voiding residual volume was not statistically different. Bethanechol potency (EC50 3µM versus 5µM) and maximal effect (31.2±5.9g/g versus 36.1±6.8g/g) in isolated bladder strips as well as number (169±4fmol/mg versus 176±3fmol/mg protein) and affinity (0.69±0.1nM versus 0.57±0.1nM) of bladder muscarinic receptors were also not statistically different.Conclusion Bladder function in vivo is altered in chronic alloxan-induced diabetes rats without changes in functional and biochemical characteristics of bladder muscarinic receptors.

Objetivo Reestudar o funcionamento da bexiga in vivo e determinar as características funcionais e bioquímicas dos receptores muscarínicos vesicais de ratos com diabetes crônico induzido por aloxana.Métodos Ratos Wistar de dois meses de idade receberam injeção de aloxana, e os animais que apresentaram glicemia >300mg/dL foram mantidos por 11 meses junto de outros não tratados e pareados por idade. Nos dois grupos de animais, peso corpóreo, peso da bexiga, glicemia e volume urinário de 24 horas foram medidos. Em ambos os grupos, realizou-se a cistometria miccional em animais não anestesiados. Foram determinados os seguintes parâmetros: pressão máxima de micção, intervalo e contração de micção, bem como o volume de esvaziamento e o volume residual pós-miccional. Além disso, foram determinadas as curvas de concentração-resposta a betanecol em preparações isoladas de bexiga e também as características dos sítios de ligação da [3H]-N-metil-escopolamina em homogenatos de bexiga.Resultados O peso médio da bexiga foi de 162,5±21,2mg versus290±37,9mg nos animais controles e tratados, respectivamente (p<0,05). A amplitude de contração (34,6±4,7mmHg versus 49,6±2,5mmHg), a duração (14,5±1,7 segundos versus 23,33±4,6 segundos) e o intervalo (87,5±17,02 segundos versus 281,11±20,24 segundos) de micção foram significantemente maiores nos ratos tratados com aloxana. O volume de urina eliminada durante a contração miccional também foi maior nos animais diabéticos. Contudo, o volume residual pós-miccional não foi estatisticamente diferente. Não foram observadas diferenças na resposta ao betanecol (EC50 3µM versus 5µM) e no seu efeito máximo (31,2±5,9g/g versus 36,1±6,8g/g) em preparações isoladas de bexiga, bem como no número total (169±43fmol/mgversus 176±3fmol/mg) e na afinidade (0,69±0,1nMversus 0,57±0,1nM) dos receptores muscarínicos da bexiga.Conclusão O funcionamento da bexiga in vivo está alterado no diabetes crônico induzido por aloxana, porém sem alterações funcionais e bioquímicas nos receptores muscarínicos da bexiga.

Implicaciones neuropsicológicas, neurológicas y psiquiátricas en un caso de intoxicación por escopolamina / Neuropsychological, neurological and psychiatric implications in a case of poisoning scopolamine

Resumen En los últimos años se han incrementado los casos de intoxicación por escopolamina con fines delictivos, con importantes repercusiones médicas, cognitivas y sociales, que requieren ser estudiadas, por ello, y ante la escasa investigación realizada en este tema, el objetivo del presente estudio es registrar las implicaciones neurológicas, neuropsicológicas y psiquiátricas en un caso de intoxicación por escopolamina mediante un diseño de caso único basado en el reporte de un hombre de 43 años de edad quien fue expuesto a una intoxicación por escopolamina cuatro meses previos a la valoración. Se realizó la valoración de la ejecución cognitiva del sujeto frente a su coeficiente intelectual y áreas relacionadas con su atención, memoria de trabajo, praxias, lenguaje, memoria, regulación emocional y funciones ejecutivas. También se aplicó la prueba de personalidad MMPI con el fin de ampliar información sobre aspectos de la personalidad del sujeto o alteraciones psiquiátricas derivadas de la intoxicación. Entre los resultados se hallaron dificultades en atención, memoria, control emocional y funciones ejecutivas; además se encontraron consecuencias psiquiátricas y neurológicas, evidenciando que la exposición a un agente tóxico que bloquee el sistema colinérgico, en especial los canales muscarinicos, puede causar la exacerbación de una enfermedad psiquiátrica premórbida.

Abstract In recent years scopolamine intoxication cases for criminal purposes has increased, with important medical, cognitive and social sequels, that need to be studied, therefore, and given the limited research on this topic, the aim of this study was to record together the implications neurological, neuropsychological and psychiatric case of poisoning scopolamine using a single case design based on the report of scopolamine intoxication about five months of a 43 year old. For this assessment was made of the subject's cognitive performance in front of their IQ and related areas with attention, working memory, praxis, language, memory, emotion regulation and executive functions. Also applied MMPI personality test to expand the information about the subject's personality or psychiatric disorders resulting from intoxication. Among the results there were found difficulties in attention, memory, emotional control and executive functions, and is a high relationship between psychiatric and neurological area, which explains that exposure to a toxic agent that blocks the cholinergic system, especially the channels muscarinic, can cause exacerbation of premorbid psychiatric illness.

Expression and function of G-protein-coupled receptorsin the male reproductive tract

This review focuses on the expression and function of muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), α1-adrenoceptors and relaxin receptors in the male reproductive tract. The localization and differential expression of mAChR and α1-adrenoceptor subtypes in specific compartments of the efferent ductules, epididymis, vas deferens, seminal vesicle and prostate of various species indicate a role for these receptors in the modulation of luminal fluid composition and smooth muscle contraction, including effects on male fertility. Furthermore, the activation of mAChRs induces transactivation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the Sertoli cell proliferation. The relaxin receptors are present in the testis, RXFP1 in elongated spermatids and Sertoli cells from rat, and RXFP2 in Leydig and germ cells from rat and human, suggesting a role for these receptors in the spermatogenic process. The localization of both receptors in the apical portion of epithelial cells and smooth muscle layers of the vas deferens suggests an involvement of these receptors in the contraction and regulation of secretion.

Esta revisão enfatiza a expressão e a função dos receptores muscarínicos, adrenoceptores α1 e receptores para relaxina no sistema reprodutor masculino. A expressão dos receptores muscarínicos e adrenoceptores α1 em compartimentos específicos de dúctulos eferentes, epidídimo, ductos deferentes, vesícula seminal e próstata de várias espécies indica o envolvimento destes receptores na modulação da composição do fluido luminal e na contração do músculo liso, incluindo efeitos na fertilidade masculina. Além disso, a ativação dos receptores muscarínicos leva à transativação do receptor para o fator crescimento epidermal e proliferação das células de Sertoli. Os receptores para relaxina estão presentes no testículo, RXFP1 nas espermátides alongadas e células de Sertoli de rato e RXFP2 nas células de Leydig e germinativas de ratos e humano, sugerindo o envolvimento destes receptores no processo espermatogênico. A localização de ambos os receptores na porção apical das células epiteliais e no músculo liso dos ductos deferentes de rato sugere um papel na contração e na regulação da secreção.

Pacientes chagásicos crônicos portadores de disfunção do nódulo sinusal: a presença de anticorpos IgG com ação agonista muscarínica independe da disfunção ventricular esquerda? / Chronic Chagas disease patients with sinus node dysfunction: is the presence of IgG antibodies with muscarinic agonist action independent of left ventricular dysfunction?

Estudos mostram que anticorpos IgG agonistas muscarínicos, de pacientes chagásicos, alteram a atividade elétrica de células cardíacas in vitro. Outros consideram sua presença, e a da síndrome do nódulo sinusal, conseqüências da lesão cardíaca progressiva. Objetivou-se avaliar a relação entre os anticorpos e as disfunções nodal e ventricular esquerda, em 65 pacientes chagásicos crônicos divididos em grupo I, composto de 31 pacientes portadores da síndrome do nódulo sinusal, e grupo II, de não portadores. A análise dos dados, pelo modelo log linear, mostrou uma interdependência entre a disfunção do nódulo sinusal e os anticorpos (p=0,0021) e entre a disfunção nodal e a ventricular (p=0,0005), mas não houve relação entre esta última e os anticorpos. Idade e sexo não tiveram influência sobre as outras variáveis. Chagásicos crônicos com a síndrome do nódulo sinusal têm maior prevalência de anticorpos agonistas muscarínicos, independentemente da presença de disfunção miocárdica.

Studies have shown that muscarinic agonist IgG antibodies from Chagas disease patients alter the electrical activity of cardiac cells in vitro. Others have considered their presence, along with sinus node dysfunction, to be consequences of progressive cardiac lesions. The aim of this study was to evaluate the relationship between these antibodies and sinus node and left ventricular dysfunction in 65 chronic Chagas disease patients. These patients were divided into group I, composed of 31 patients with sinus node dysfunction, and group II, composed of the patients without this syndrome. Data analysis using the log linear model showed interdependence between sinus node dysfunction and the antibodies (p = 0.0021) and between nodal and ventricular dysfunction (p = 0.0005). However, no relationship was found between the antibodies and ventricular function. Age and sex did not influence any other variables. The chronic Chagas disease patients with sinus node dysfunction had higher prevalence of muscarinic agonist antibodies, independent of the presence of myocardial dysfunction.

Avaliação da via eferente vagal em ratos nas fases aguda e crônica do infarto do miocárdio / Evaluation of the Efferent Vagal Limb in Acutely and Chronically Infarcted Rats

PURPOSE--To investigate the sensitivity of the muscarinic receptors to acetylcholine (Ach) and to vagal stimulation in rats during the acute and the chronic phases of myocardial infarction (MI). METHODS--Male albino rats were submitted to ligature of the descending anterior branches of the left coronary artery to produce MI. Control rats (Con) were submitted to a sham surgery. The animals were studied 1-3 days (acute phase) or 30 days (chronic phase) after surgery. Under anesthesia (ketamine+xylazine) the right vagus nerve was isolated at the neck and stimulated with suprathreshold pulses (2ms, 1-64Hz). Atrial and ventricular rates were measured in the ECG recording. Dose-response curve to Ach (5-80 micrograms) was studied in the isolated hearts perfused according to the Langendorftechnique. Atrial and ventricular rates were evaluated through the surface electrogram recording. The left ventricular pressure was measured with an intraventricular balloon. RESULTS--Basal heart rate in the anesthetized animals was similar in Con and MI rats. The vagal stimulation produced a frequency dependent reduction of the heart rate. This reduction was less intense in the MI groups to stimulation rates of 32 and 64Hz. It was not observed any difference in the sensitivity of sinus and AV nodes to exogenous Ach in infarcted hearts. The reduction of the systolic pressure obtained after Ach administration to the hearts paced artificially (3.3Hz) was similar in MI and Con hearts. CONCLUSION--MI hearts were less sensitive to vagal stimulation than Con hearts. Since the in vitro effects of Ach remained unchanged after infarction, these results suggest an impairment of the cardiac neuroeffector vagal synapse. This may contribute to a less efficient control of the heart rate by the parasympathetic pathway in infarcted individuals.

Objetivo − Determinar a sensibilidade dos receptores muscarínicos à acetilcolina (Ach) e ao estímulo vagal em ratos nas fases aguda e crônica do infarto do miocárdio (IM). Métodos −Ratos albinos machos submetidos à ligadura dos ramos descendentes anteriores da artéria coronária esquerda para produção do IM. Os ratos controles (Con) foram submetidos a cirurgia fictícia. Grupos de animais foram estudados 1-3 (fase aguda) ou 30 dias (fase crônica) após a cirurgia. Sob anestesia (ketamina + xilazina), o nervo vago direito era isolado na altura do pescoço e estimulado com pulsos supralimiares (2ms) nas freqüências de 1 a 64Hz. A redução das freqüências atrial e ventricular foi analisada pelo registro contínuo do ECG. A sensibilidade dos marcapassos sinusal e AV à Ach (5-80µg) foi estudada em corações isolados, perfundidos pela técnica de Langendorf, registrando-se o eletrograma de superfície e a pressão ventricular desenvolvida em sístoles isovolúmicas. Resultados − A freqüência cardíaca (FC) basal sob anestesia foi similar nos animais Con e IM. A estimulação vagal produziu redução progressiva da freqüência sinusal em todos os grupos. Nos animais com IM, entretanto, a redução de FC foi significantemente menor (p<0,05) na estimulação de 32 e 64Hz. Não se detectou nenhuma diferença na sensibilidade dos nódulos cardíacos ao efeito da Ach in vitro. Além disso, a redução da pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo, sob efeito de Ach nos corações estimulados artificialmente (3,3Hz), foi similar nos corações Con e IM. Conclusão − Os corações com IM foram sensíveis à descarga vagal. Uma vez que não se detectou alteração ao nível dos receptores muscaríneos pós-juncionais, estes dados sugerem existir alteração da sinapse neuro-efetora vagal cardíaca. Isso poderia contribuir para reduzir a participação do controle vagal sobre a FC após o infarto